菌落總數(shù)(Totalcoliforms)是判定水質被細菌污染程度的重要指標之一，其測定方法也有一定的標準。平皿計數(shù)法是早期傳統(tǒng)的水中菌落總數(shù)標準檢測方法，其應用研究也比較多，如錢冬梅應用平皿計數(shù)法測定了生活飲用水中的菌落總數(shù)。這種方法實驗步驟較為繁瑣，對操作人員的專業(yè)水平要求比較高，不適用于應急快速檢測，無法對水的衛(wèi)生狀況做出快速評價。

　　酶底物法是近些年來新興的水中菌落總數(shù)檢測方法，操作簡便，結果易判斷，適用于快速檢測。但不少用戶對此種方法存疑，不知道這種方法出來的檢測結果是否科學準確，下面優(yōu)爾普就以平皿計數(shù)法的檢測結果為準，用酶底物法程控定量封口機進行實驗檢測對比。

立科酶底物法程控定量封口機

酶底物法快速檢測水中菌落總數(shù)實驗

一、實驗操作部分

1、實驗原理

　　酶底物法使用的復合酶技術培養(yǎng)基包含多種獨特的酶物質，每種酶物質都針對不同的細菌酶設計(包含普遍的水介傳播細菌)，所有的酶底物被分解時均產生相同的信號。在檢測菌落總數(shù)時，這個信號顯示為365納米紫外4O城鎮(zhèn)供水NO.22013燈下的熒光。

2、材料與試劑

　　立科定量盤、lmL移液管或移液槍、10mL移液管或移液槍、培養(yǎng)箱(35±1)、6瓦366FIITI紫外燈、紫外燈箱(23cmx30onx17on1)、無菌水。

3、方法步驟

酶底物法檢測方法操作步驟

(1)首先向100mL裝有固體培養(yǎng)基的瓶中加入無菌水至刻度，搖勻，制成液體培養(yǎng)基，然后放置在冰箱中保存，使用有效期為5天。見圖1。

(2)取1mL水樣及9mL液體培養(yǎng)基倒入立科定量盤中。見圖2。

(3)將定量盤蓋好，在水平桌面上旋動將所有水樣分配到定量盤的孔中(孔中的氣泡不會影響結果)。見圖3。

(4)將定量盤豎起呈垂直90度，將多余的水樣由盤內海綿吸收。見圖4。

(5)將定量盤緩慢翻轉過來，于培養(yǎng)箱中(35±0.5)培養(yǎng)48h(若結果為可疑陽性則延長培養(yǎng)時間至72h)。見圖5。

(6)計數(shù)：培養(yǎng)完成后將培養(yǎng)盤蓋打開，用紫外燈在定量盤上方13on處照射，數(shù)顯熒光的孔數(shù)。對照MPN表得出結果。注意：海綿條顯熒光不必記錄在讀數(shù)范圍內。由于本方法的最大檢測上限為738MPN/mL，如需稀釋時，將結果乘以稀釋倍數(shù)即為報告讀數(shù)(如稀釋l0倍時的操作為：加入0.1mL樣品和9.9mL液體培養(yǎng)基)。

二、結果與分析

1、盲樣比對實驗--T檢驗分析

　　選取三個水質檢測實驗室對比同一盲樣(標準試劑)進行酶底物法和平皿計數(shù)法比對試驗，具體試驗結果如圖。

EPA標準盲樣檢測結果

　　對比以上酶底物法和平皿計數(shù)法檢出共160個結果進行配對T檢驗，兩種方法的配對T檢驗結果如下表。

配對檢驗結果

　　標配比變量差值的T檢驗結果，Mean均值之間的差值為-1.78750，Std.Deviation差值的標準差16.10385，Std.ErrorMean差值的調準誤為1.80047，95%ConfidenceIntervaloftheDifference置信區(qū)間上下限為-5.37124和1.79624，t-valuet值為-0.993，df自由度為79，Sig(2-tailed)雙尾T檢驗的結果，獲得t值的概率P值為0.324，檢驗結果表明酶底物法和平皿計數(shù)法檢測結果沒有統(tǒng)計學意義上的差別(P<0.50)。

2、水樣檢測--線性回歸分析

　　采集地表水水樣進行檢測，為保證實驗結果的有效性和方便統(tǒng)計，要求檢測高、低濃度兩個水樣，同時，要求低濃度水樣的MPN值控制在50MPN/ml左右，高濃度水樣的MPN值控制在100MPN/ml左右，分別從國內9個地區(qū)采集水樣，試驗結果如圖。

實驗室水樣檢測結果

　　對以上9家實驗室用酶底物法和平皿計數(shù)法共1160個檢測結果進行線性回歸統(tǒng)計分析，兩種方法線性回歸分析見下表。

檢測結果線性回歸統(tǒng)計分析

　　從圖表中可知，標準化回歸系數(shù)Beta為0.95，表明兩組數(shù)據(jù)相關性較好，兩種方法的檢測結果具有可比性。檢驗結果P=0.00，均小于0.05，表明兩種方法在檢測菌落總數(shù)時沒有顯著差異性，具有等效性。此結果說明酶底物法的測定結果準確、可靠，可以替代平皿技術發(fā)作為水中菌落總數(shù)的測定方法。

　　從上述實驗可以看出，酶底物法快速檢測水中菌落總數(shù)的檢測結果與平皿計數(shù)法無統(tǒng)計學意義上的差別，是科學的、有效的、準確的，可以用作評價水質微生物污染的標準依據(jù)。酶底物法操作簡單，結果判讀容易、準確，無需稀釋即可檢測738個/1mL水樣，不僅適用于水源水、飲用水的檢測，還適用于應急檢測和污水檢測，易于推廣，可以較好的彌補傳統(tǒng)方法的不足。